細胞裂解與蛋白質定量

更新時間：2014-09-20

點擊次數：3621

細胞裂解與蛋白質定量

Solarbio提供的細胞裂解液：

貨號	R0010	R0020	R0030
名稱	RIPA組織細胞裂解液	RIPA組織細胞裂解液	非變性組織細胞裂解液
有效裂解成分	SDS，NP-40，脫氧膽酸鈉，	1% NP-40，0.1% SDS	NP-40，Triton X-100
裂解強度	強	中	溫和
蛋白酶抑制劑	含, 配有PMSF	含，配有PMSF	含，配有PMSF
產物	細胞總蛋白	細胞總蛋白	細胞總蛋白
蛋白狀態(tài)	變性	變性	保持活性狀態(tài)
主要用途	WB、IP	WB、IP	WB, IP,co-IP

本系列試劑隨同配送一支PMSF，請收到后-20℃保存。RIPA裂解液4℃保存，如發(fā)現有少量沉淀，可常溫放置半小時，沉淀可消失，不影響使用。

使用裂解液在提取核蛋白的同時，也會將基因組一并釋放出來，細胞量高時會造成細胞裂解液粘稠，此時可以直接加入蛋白上樣緩沖液，煮沸再離心，離心取上清直接上樣電泳；若想測定濃度，可入加少量SDS（1%），煮沸后離心測濃度。本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑，所以不適合使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒，請選擇BCA法或者Lowry法檢測蛋白濃度。

如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散粘稠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。

蛋白質定量：

蛋白含量測定是以標準蛋白作為對照，根據蛋白濃度不同，吸光值不同而達到定量的目的。有些方法是理解蛋白本身的吸光值（紫外光譜吸收法）來定量，但更多的是用染料對蛋白進行染色，利用染料與蛋白結合顯出與原染料及蛋白不同的吸光值來定量的。后一種方法應用更普遍。

蛋白定量方法的選擇，應該考慮到蛋白結構（標準品選擇）、蛋白溶液內干擾物等因素的影響。

	Bradford法	BCA法	Lowry法
原理	考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合呈藍色，在波長595nm吸收峰	基于雙縮脲原理，堿性條件下蛋白質將Cu²⁺還原成Cu1⁺，BCA螯合Cu⁺作為顯色劑，產生蘭紫色并在562nm有吸收峰。	Folin－酚法，蛋白質在堿性溶液中肽鍵與Cu²⁺螯合，形成蛋白質一銅復合物，還原酚磷鉬酸產生藍色化合物。
靈敏性	高微量:1-10ug/ml, 常規(guī)：100-1500ug/ml	很高微量:0.5-20μg/ml 常規(guī)：20-2000ug/ml	較高 1-1500ug/ml
干擾因素	強堿性緩沖液 TritonX-100 SDS等去污劑	螯合劑略高濃度的還原劑（優(yōu)勢：耐受一般濃度去污劑）	硫酸銨；Tris緩沖液甘氨酸、各種硫醇（優(yōu)勢：適用于脂類含量高的樣品測定。耐受去垢劑如SDS）
應用	快速5-15min 顏色穩(wěn)定標準曲線有輕微的非線性	較快40min 較好的方法抗干擾能力強	耗費時間長50min 操作要嚴格計時顏色深淺隨不同蛋白質變化標準曲線線性差且專一性差

考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經研究認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩(wěn)定，且在5分鐘20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性好。由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差。去污劑、 Triton X-100、十二烷基*（SDS）干擾此法的測定。

BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白質定量方法。該方法因快速靈敏、穩(wěn)定可靠，對不同種類蛋白質檢測的變異系數非常小而倍備受專業(yè)人士的青睞。該方法的原理是，在堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫色的絡合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質的影響。在組織細胞裂解實驗中，低濃度的去垢劑SDS，Triton X-100，Tween不影響檢測結果，但螯合劑（EDTA，EGTA）、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類會對檢測結果有一定影響。實驗中，若發(fā)現樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高，可試用Bradford法測定蛋白濃度。

Lowry法蛋白質測定法是靈敏的方法之一。過去此法是應用廣泛的一種方法，在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。 Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高，缺點是費時間較長，要控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。